retrotrascrizione con primer specifici (2025)

Per fare una retrotrascrizione (RT) ci sono 3 strategie che prevedono l'ultilizzo di tipi di primers diversi per retrotrascrivere l'RNA in cDNA:
1) oligodT --> retrotrascrivi tutto l'mRNA, ma non retrotrascrivi gli altri RNA (che non hanno la codina di poli-A)
2) random primers --> retrotrascrivi tutto l'RNA (sia mRNA che gli altri RNA)
3) primer specifico --> retrotrascrivi solo l'RNA relativo al tuo gene di interesse

poi dopo aver retrotrascritto puoi fare la PCR del cDNA ottenuto, quindi in sostanza partendo dall'RNA e arrivando all'amplificato della PCR fai una "RT-PCR", la RT-PCR può essere fatta in due modi:
1) ONE-Step: metti nella stessa provetta assieme all'RNA tutti i reagenti e i due enzimi, retrotrascrittasi e DNA-polimerasi. Si ha una prima fase in cui viene retrotrascritto l'RNA e poi si ha la fase di amplificazione.
2) TWO-Step: metti in una prima provetta i reagenti per la retrotrascrizione e la retrotrascrittasi e produci il cDNA. Poi prendi il cDNA prodotto e lo metti in una seconda provetta assieme ai reageti per la PCR e alla DNA-polimerasi e lo amplifichi.

Sia nella ONE-step che nella TWO-Step puoi utilizzare uno qualsiasi dei primer detti prima. Anche se nella ONE-step è molto più comunque usare i primers specifici si possono usare benissimo anche gli altri.
Sia con la ONE-step che nella TWO-Step puoi fare la real-time.
Nella ONE-step non è che fai prima la One-step e poi la real-time e quindi ti trovi una Taq in più di mezzo, ma semplicemente metti tutti i reagenti per la real-time nella mix iniziale (assieme ai due enzimi che sono sempre retrotrascrittasi e DNA-polimerasi) e metti nello strumento per la real time, per la precisione si chiama: "One-step RT-qPCR"

Poi i motivi per cui si preferisce utilizzare una strategia piuttosto che l'altra sono veramente tanti e dipende da cosa devi fare.
La retrotrascrizione non la fai solo per farci una realtime, ma ad es. puoi farla per fare un clonaggio, in quel caso a volte può essere vantaggioso usare un primer specifico piuttosto che un oligo dT, i random primers invece non si usano di certo.
Se invece hai bisogno di andare a vedere vari RNA, e non solo i messaggeri (sia in real-time che per altre applicazioni) allora devi utilizzare random primers.
Insomma i casi sono tanti e bisogna valutare di volta in volta in base a quello che si deve fare.
Anche sulla scelta di ONE-step piuttosto che TWO-Step i fattori sono molti e ci sono vari pro e contro.

In parte risponde alla mia domanda: Anche in una two-step Il primer utilizzato per retrotrascrivere puó essere utilizzato come reverse nelle amplificazioni successive
Ciao a tutti